Lowry 法測定 B 型肉毒神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)含量

肉毒毒素是肉毒梭狀芽孢桿菌生長、繁殖過程中產(chǎn)生的細(xì)菌外毒素，根據(jù)抗原性分為 7 個型（A、B、C、D、E、F 和 G 型）。在治療頸部肌肉痙攣方面，B 型肉毒毒素是一種安全、有效的物質(zhì)，但常伴隨吞咽困難、震顫、血腫、頸部疼痛、無力、惡心、張力過高和注射部位疼痛等不良反應(yīng)。隨著肉毒毒素各類產(chǎn)品的應(yīng)用日益廣泛，當(dāng)前對肉毒毒素基礎(chǔ)研究和提高制品質(zhì)量研究更顯重要。凱氏定氮法被國內(nèi)外視為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法，《中國藥典》四部（2020 年版）項下凱氏定氮法是通過測定供試品中的氮來計算出蛋白質(zhì)含量。但供試品中除了含有蛋白質(zhì)的有機氮也含有無機氮，在測定蛋白質(zhì)含量的過程中如何減少或排除無機氮的影響成為 B 型肉毒神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)含量測定的關(guān)鍵技術(shù)。凱氏定氮法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但試驗用時長，消耗樣品量多，操作步驟煩瑣，目前進行蛋白定量并不是首選方法。為尋找適合 B型肉毒神經(jīng)毒素中蛋白質(zhì)含量的測定方法，本文通過自建的 Lowry 法與藥典方法進行線性關(guān)系、精密度試驗和重復(fù)性試驗的比對研究，并使用自建的 Lowry 法對 B 型肉毒神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)含量進行回收率測定。

材料與方法

樣品

試驗用 3 批 B 型肉毒神經(jīng)毒素溶液樣品（編號：B-1、B-2、B-3）由蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司醫(yī)美研發(fā)中心提供。

儀器

紫外分光光度計（UV-1800上海美析儀器有限公司），

酶標(biāo)儀

試劑

Folin酚試劑（SIGMA公司），

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：140619-202125），

碳酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純），

注射用水為公司自制。

溶液的配制

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 20.0 mg，置于 100 mL 容量瓶中，加注射用水溶解并定容至刻度，搖勻，即得 0.2 mg·mL ^-1 的標(biāo)準(zhǔn)品母液。

標(biāo)準(zhǔn)品線性工作液：精密量取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，分別置于 10 mL 容量瓶中加注射用水定容至刻度，制成0 mg·mL ^-1 、0.01 mg·mL ^-1 、0.02 mg·mL ^-1 、0.05 mg·mL ^-1 、0.10 mg·mL ^-1 、0.15 mg·mL ^-1 和0.20 mg·mL ^-1的標(biāo)準(zhǔn)品線性工作液。

試驗方法

藥典方法

按《中國藥典》四部（2020 版）通則 0731 項下第二法福林酚法測定 B 型肉毒神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)含量。

本方法（Lowry 法）

精密移取標(biāo)準(zhǔn)品線性工作液和供試品溶液各50 μL，分別置 96 孔紫外檢測板中；各加堿性銅試液 50 μL，室溫放置 10 min；各加福林酚試液 [ 取福林酚試液中的貯備液（2 mol·L -1 酸濃度）1-16] 200 μL，振蕩搖勻后室溫放置 5 min；使用酶標(biāo)儀在 650 nm 波長處測定吸光度，以牛血清白蛋白化學(xué)對照品溶液濃度對其相應(yīng)吸光度計算線性回歸方程，求得直線回歸方程（y=ax+b）。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。

統(tǒng)計學(xué)方法

運用 SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，對本方法和藥典方法標(biāo)準(zhǔn)曲線進行線性回歸分析；對兩種方法精密度試驗測定值進行配對 t 檢驗分析（α=0.05），計算 P ＞ 0.05 時兩組測定值之間無統(tǒng)計學(xué)差異；對兩種方法重復(fù)性試驗測定值進行單組設(shè)計 t 檢驗（α=0.05） [9] ，計算 P ＞ 0.05 時兩組測定值之間無統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié)果與分析

線性關(guān)系比較: 藥典方法線性濃度范圍為 0.04 ～0.20 mg·mL -1 ，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度對吸光度進行線性回歸y=2.807 5x+0.042 3，R 2 =0.997 2，t=32.883，p ＜ 0.05。由圖2知，本方法線性濃度范圍為0.01～0.20 mg·mL -1 ，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度對吸光度進行線性回歸y=1.917 9x+0.051 9，R 2 =0.998 7，t=55.236，p ＜ 0.05；說明兩種方法的線性都具有良好的相關(guān)性。

精密度試驗比較: 使用本方法和藥典方法分別對不同濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（濃度分別為 0.05 mg·mL -1 、0.08 mg·mL -1 、0.16 mg·mL -1 ）進行6次測定，其測定結(jié)果見表1。由表1可知，兩種方法測定值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.48%～1.65%，小于 2%，均符合質(zhì)控要求，但藥典方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差比本方法大，說明本方法具有更好的精密度。對兩種方法的測定值進行配對 t 檢驗分析：t 0.05 =1.449，P 0.05 =0.207 ＞ 0.05；t 0.08 =2.137，P 0.08 =0.086 ＞ 0.05；t 0.16 =0.662，P 0.16 =0.537 ＞ 0.05，均無顯著性差異，說明本方法和藥典方法在蛋白質(zhì)含量測定中具有一致性。

重復(fù)性試驗: 分別采用本方法和藥典方法，測定 3 批 B 型肉毒神經(jīng)毒素原液中蛋白質(zhì)含量，做 6 次平行試驗，測定結(jié)果見表 2。由表 2 可知，兩種方法測定值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在 0.72% ～ 1.87%，小于 2%，均符合質(zhì)控要求，且本方法具有更好的重復(fù)性。將本方法與藥典方法樣品測定值進行單組設(shè)計的 t 檢驗：t B-1 =-1.989，P B-1 =0.072 ＞ 0.05；t B-2 =2.058，P B-2 =0.064 ＞ 0.05；t B-3 =-1.413，P B-3 =0.185 ＞ 0.05，均無顯著性差異。表明在 B 型肉毒神經(jīng)毒素蛋白含量測定中，本方法與藥典方法測定值具有一致性。

加樣回收試驗:為進一步確定本方法在實際樣品測定的準(zhǔn)確度，使用實際樣品中加標(biāo)準(zhǔn)品的方式，采用本方法測定 3個不同濃度加標(biāo)樣品中蛋白質(zhì)含量，每組做 3 個平行試驗，測定結(jié)果見表 3。由表 3 可知，本方法回收率為97.16%～108.46%，在85%～110%的范圍內(nèi)，符合該測定含量下回收率質(zhì)控要求。通過加標(biāo)回收試驗可以看出，本方法可以獲得較滿意的回收率，試驗準(zhǔn)確度高。

結(jié)論

通過對藥典方法和本方法的一系列比較及測定，得出以下結(jié)論。①兩種方法都具有良好的線性關(guān)系，但本方法的線性關(guān)系優(yōu)于藥典方法，且線性絕對系數(shù)優(yōu)于藥典方法。②在測定標(biāo)準(zhǔn)品和實際樣品時，兩種方法均表現(xiàn)出較好的精密度和重復(fù)性。本方法精密度和重復(fù)性測定值與藥典方法測定值統(tǒng)計學(xué)分析均無顯著性差異，說明兩種方法在理論上均可用于 B 型肉毒神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)含量測定。③通過回收率試驗可以得出，本方法回收率符合該測定含量下回收率質(zhì)控要求。④本方法在檢測過程中大幅度縮短測定周期，提高了檢測效率；檢測所用供試品少，減少了樣品的損失。綜上所述，本方法具有快速、省時、方便、需要供試品量少等優(yōu)點，更適合 B 型肉毒神經(jīng)毒素中蛋白質(zhì)含量的測定。

儀器參數(shù)

UV-1800PC雙光束紫外可見分光光度計

儀器特點

* UV－1800系列采用雙光束光學(xué)系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了高精度和高可靠性測量的完美結(jié)合，可滿足各種應(yīng)用的要求，可用在生物研究、生物工業(yè)、藥物分析、制藥、教學(xué)研究、環(huán)保、食品衛(wèi)生、臨床檢驗、衛(wèi)生防疫等領(lǐng)域

* 寬廣的波長范圍，可滿足各個領(lǐng)域?qū)ΣㄩL范圍的要求

* 全自動的設(shè)計理念，實現(xiàn)了最簡單的測量手段

* 大規(guī)模集成電路的設(shè)計大大提高了系統(tǒng)的擴展性和可靠性

* 改良優(yōu)化的光路設(shè)計、進口光源和接收器造就了系統(tǒng)高性能和高可靠性

* 豐富的測量方法，具有波長掃描、時間掃描、多波長測定、多階導(dǎo)數(shù)測定（選）、雙波長、三波長（選）DNA蛋白質(zhì)測量（選）等多種測量方法，可滿足不同測量的要求，并可在6英寸大屏幕上直接顯示

* 根據(jù)用戶的要求可選配單孔架、手動四連架、手動八連架、自動八連架、玻璃支架、試管架、1cm比色架、5cm比色架、10cm比色架等

* 測量數(shù)據(jù)可通過打印機輸出，具有USB接口

* 可斷電保存測量參數(shù)和數(shù)據(jù)，方便用戶使用

* 可通過PC軟件控制實現(xiàn)光譜掃描等更精確和靈活的測量要求

技術(shù)指標(biāo)及基本參數(shù)

* 波長范圍：190～1100nm

* 光譜帶寬：1.8nm

* 波長準(zhǔn)確度：±0.3nm

* 波長重現(xiàn)性：≤0.1nm

* 透射比準(zhǔn)確度: ±0.3% τ（0-100%τ）±0.002A(0～0.5A)   ±0.003A(0.5A～1A)

* 透射比重復(fù)性：±0.15% τ（0-100%τ）±0.001A(0～0.5A)   ±0.0015A(0.5A～1A)

* 雜散光：≤0.03% τ (220nm NaI，340nm NaNO2)

* 穩(wěn)定性： 0.0005A/h（500nm預(yù)熱后）

* 測光方式：透過率、吸光度、濃度、能量

* 波長調(diào)節(jié)：自動調(diào)節(jié)

* 光度范圍： -4～4A

* 顯示方式：六英寸高亮度液晶顯示屏

* 檢測器：進口硅光二極管

* 光源：進口氘燈，進口鎢燈

* 電源： AC 220V/50Hz或110V/60Hz

* 功率： 120W

* 儀器尺寸：560×450×230mm

* 主機凈重： 28Kg

關(guān)于我們

上海美析儀器公司簡介

上海美析儀器有限公司(以下簡稱美析)，是一家具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高新技術(shù)企業(yè)，美析的創(chuàng)業(yè)理念“科技——因你改變”，并以此為企業(yè)宗旨，不斷探究、果敢創(chuàng)新。特別是在分析測試儀器領(lǐng)域，不斷開發(fā)出先進的產(chǎn)品，使美析成為優(yōu)質(zhì)儀器資源的供應(yīng)者。

美析主營光譜類儀器可見分光光度計、紫外可見分光光度計、原子吸收光譜儀、超微量分光光度計、原子熒光光度計、ICP 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、ICP 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，目前，我們的產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于有機化學(xué)、無機化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)保、冶金、石油、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。同時美析利用在產(chǎn)品機械結(jié)構(gòu)、光學(xué)設(shè)計、電氣應(yīng)用和軟件開發(fā)方面積累的豐富經(jīng)驗，結(jié)合市場的最新實際需求，近期將陸續(xù)推出一批全新的分析類儀器。美析的總部及生產(chǎn)基地設(shè)在上海，營銷中心設(shè)在北京，并在江蘇、上海、山東三地建有研發(fā)基地。為充分利用各地的智力資源，美析與國內(nèi)外的部分科研單位也進行了深層次的科研合作，不斷將科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。為更好的服務(wù)于廣大客戶，美析儀器國內(nèi)設(shè)有 12家辦事機構(gòu)，度身定制符合您需求的應(yīng)用解決方案，提高產(chǎn)品的附加值。在不斷服務(wù)國內(nèi)用戶的同時，美析也與 20 多個國家的分銷機構(gòu)建立了深度的戰(zhàn)略合作關(guān)系。

及國內(nèi)多項資質(zhì)審查認(rèn)證，并有著多項自行研發(fā)的光譜類專利版權(quán)等等）