植物過氧化物酶活性測定實(shí)驗(yàn)方法的改良

引言

過氧化物酶（Peroxidase，POD）是一種活性較高、廣泛存在于植物組織器官中的氧化還原酶，以鐵卟啉為輔基，能催化過氧化氫直接氧化酚類或胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用，有效防止過氧化氫在體內(nèi)的積累，從而對植物體起到保護(hù)作用；同時，過氧化物酶能使植物組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素,是細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶。所以，它與植物體內(nèi)物質(zhì)代謝及抗逆性都有著密切關(guān)系。因此，過氧化物酶活性測定實(shí)驗(yàn)常作為一個重要的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定。同時， “過氧化物酶活性的測定”也是植物生理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的經(jīng)典性實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生掌握過氧化物酶活性的原理及實(shí)驗(yàn)方法，了解過氧化物酶在植物生長發(fā)育和抵抗逆境中的作用。在實(shí)驗(yàn)中，過氧化物酶活性測定方法有多種，如愈創(chuàng)木酚法、聯(lián)苯胺法、熒光法等，最常用的方法是愈創(chuàng)木酚法。愈創(chuàng)木酚法雖然具有很多優(yōu)點(diǎn)，但也有不足之處。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，我們發(fā)現(xiàn)即使是相同的方法，不同的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書所要求的反應(yīng)時間、溫度及磷酸緩沖液pH也有所差異，不同條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不盡相同，甚至截然相反；在測定時，一般要求反應(yīng)時間在3-5 min之間，在代入公式進(jìn)行計算時，經(jīng)常由于反應(yīng)時間的取值范圍不準(zhǔn)確而得到錯誤結(jié)果，這不僅挫敗了學(xué)生動手操作的積極性，也降低了實(shí)驗(yàn)效率。因此，對愈創(chuàng)木酚法測定植物體內(nèi)過氧化物酶活性實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了研究，將其完善，使實(shí)驗(yàn)條件更適合學(xué)生操作，在規(guī)定的時間內(nèi)達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。本實(shí)驗(yàn)以菠菜、娃娃菜和馬鈴薯皮為材料，比較了過氧化物酶活性測定的反應(yīng)時間、緩沖液pH值、溫度及稀釋倍數(shù)對過氧化物酶活性測定的影響，旨在優(yōu)化植物體內(nèi)過氧化物酶活性測定條件，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科研提供參考。

材料

供試材料為菠菜葉片、娃娃菜葉片和馬鈴薯皮。

試劑與儀器

主要試劑包括

愈創(chuàng)木酚、過氧化氫、磷酸緩沖液、濃磷酸和三氯乙酸，均為國產(chǎn)，分析純。主要儀器包括

UV-1500型紫外可見分光光度計（上海美析儀器有限公司），

D3024R型高速冷凍離心機(jī)，

HSY-24型水浴鍋，

MP4002型電子天平

試驗(yàn)方法

愈創(chuàng)木酚法

實(shí)驗(yàn)以鄰甲氧基苯酚（即愈創(chuàng)木酚）為過氧化物酶的底物，在過氧化物酶催化下，過氧化氫可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚。該物質(zhì)在470 nm處有最大吸收，可用分光光度計測量470 nm處的吸光度變化，作出 時間-光吸收值的曲線，求出曲線的斜率，代入相應(yīng)的公式計算測定過氧化物酶活性。

（1）酶液提?。悍Q取菠菜葉、娃娃菜葉和馬鈴薯皮各0.5 g，剪碎，分別放入研中，加入2 ml磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH分別為5.5、7.0、7.8）研磨成勻漿（冰浴研磨），再加入8ml磷酸緩沖液，將勻漿液分多次全部轉(zhuǎn)入離心管中，5000 r/min、4 ℃下離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入10 ml容量瓶，定容至刻度，低溫下保存?zhèn)溆?，上清液即為酶的粗提取液?span>

（2）酶活性測定：酶活性測定分別在溫度 25 ℃、30 ℃、37 ℃條件下進(jìn)行，取5 ml反應(yīng)混合液（磷酸緩沖液3 mL、0.05 mol /L 愈創(chuàng)木酚1 mL和1 mL 2% 過氧化氫，搖勻），加入1 ml的粗酶提取液（分別稀釋2倍、4倍、10倍），立即搖勻，并迅速倒入比色皿中，于470 nm波長下比色，立刻記錄吸光度值，以后每30 s記錄1次，共計3 min，以緩沖液代替酶液作對照調(diào)零。作出A ₄₇₀ 與時間t關(guān)系曲線，在曲線前期部分找一段近似直線部分，即反應(yīng)的初速度階段。按下式計算酶活性：

式中，?A ₄₇₀ 為反應(yīng)初速度階段內(nèi)吸光度的變化；

m為植物材料質(zhì)量（g）；

Δ_t為?A ₄₇₀ 對應(yīng)的反應(yīng)時間（min）；

V _T 為提取酶液總體積（mL）；

V _S 為測定時取用酶液體積（mL）；

0.01為以吸光度值（ΔA ₄₇₀ ）變化0.01為1個酶活性單位（U）

三氯乙酸終止法

步驟如下：酶液提取方法與愈創(chuàng)木酚法相同，而在酶活性測定時，在反應(yīng)體系中加入酶液后，立即放置于于37 ℃水浴中保溫反應(yīng)15 min，然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中，并加入20%三氯乙酸 2 mL終止反應(yīng)，適當(dāng)稀釋，470 nm波長下測定吸光度。用加熱煮沸5 min的酶液作為對照。

結(jié)論

通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，愈創(chuàng)木酚法測定POD活性的時間取值范圍應(yīng)為0-90 s，緩沖液適宜pH值為5.5、溫度為37 ℃，POD活性與稀釋倍數(shù)之間呈現(xiàn)出近似于線性的關(guān)系，稀釋倍數(shù)增加，酶活性逐漸降低，可根據(jù)所測定的A 470 值進(jìn)行稀釋，使所測定的光吸收值處于分光光度計讀數(shù)0.2-0.8之間，以減少誤差。在選取實(shí)驗(yàn)材料時，可選用新鮮的娃娃菜和馬鈴薯皮，取材方便且酶活性較高，穩(wěn)定性較好，能取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菠菜的粗酶提取液的酶活力較低，不合適作為該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料。三氯乙酸終止反應(yīng)法不適用于這三種材料。本實(shí)驗(yàn)對植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)及相關(guān)科學(xué)研究有一定的參考價值。

文章來源：呂春芳,李海霞,賈然然等. 植物過氧化物酶活性測定實(shí)驗(yàn)方法的改良 [J]. 輕工科技, 2024, 40 (02): 15-18.

儀器參數(shù)

UV-1500PC紫外可見分光光度計

儀器特點(diǎn)

*采用單片微機(jī)控制，128*64位液晶顯示

*寬大的液晶顯示器可顯示多組數(shù)據(jù)

*巨大的內(nèi)存空間，可存儲多組數(shù)據(jù)和曲線

*自動調(diào)0、調(diào)100%功能

*波長自動調(diào)節(jié)

*光源自動切換，濾色片自動切換

*寬大樣品池（5mm～100mm）

*具有最多十點(diǎn)標(biāo)樣建標(biāo)準(zhǔn)曲線測量功能

*可通過直接輸入K、B因子建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測量

*可直接輸入標(biāo)樣和對應(yīng)濃度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測量

*可斷電保存測量設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

*配備通用并行打印接口，可打印標(biāo)題欄、測量數(shù)據(jù)、曲線參數(shù)、曲線標(biāo)準(zhǔn)樣品點(diǎn)和曲線

*配USB接口

*可通過PC軟件控制實(shí)現(xiàn)光譜掃描等更精確和靈活的測量要求

技術(shù)指標(biāo)及基本參數(shù)

*波長范圍： 190～1100nm

*光譜帶寬： 2nm

*波長準(zhǔn)確度：±0.5nm

*波長重現(xiàn)性：≤0.2nm

*透射比準(zhǔn)確度: ±0.3% τ

*透射比重復(fù)性：0.15% τ

*雜散光：≤0.05% τ (220nm NaI，340nm NaNO2)

*穩(wěn)定性： 0.001A/h（500nm預(yù)熱后）

*測光方式：透過率、吸光度、濃度、能量

*波長調(diào)節(jié)：自動調(diào)節(jié)

*光度范圍： -0.3～3A

*顯示方式： 128*64液晶

*檢測器：進(jìn)口硅光二極管

*光源：進(jìn)口氘燈，進(jìn)口鎢燈

*電源： AC 220V/50Hz或110V/60Hz

*功率： 120W

*儀器尺寸：480×350×220mm

*主機(jī)凈重： 15Kg

關(guān)于我們

上海美析儀器公司簡介

上海美析儀器有限公司(以下簡稱美析)，是一家具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高新技術(shù)企業(yè)，美析的創(chuàng)業(yè)理念“科技——因你改變”，并以此為企業(yè)宗旨，不斷探究、果敢創(chuàng)新。特別是在分析測試儀器領(lǐng)域，不斷開發(fā)出先進(jìn)的產(chǎn)品，使美析成為優(yōu)質(zhì)儀器資源的供應(yīng)者。

美析主營光譜類儀器可見分光光度計、紫外可見分光光度計、原子吸收光譜儀、超微量分光光度計、原子熒光光度計、ICP 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、ICP 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，目前，我們的產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)、無機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)保、冶金、石油、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。同時美析利用在產(chǎn)品機(jī)械結(jié)構(gòu)、光學(xué)設(shè)計、電氣應(yīng)用和軟件開發(fā)方面積累的豐富經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合市場的最新實(shí)際需求，近期將陸續(xù)推出一批全新的分析類儀器。美析的總部及生產(chǎn)基地設(shè)在上海，營銷中心設(shè)在北京，并在江蘇、上海、山東三地建有研發(fā)基地。為充分利用各地的智力資源，美析與國內(nèi)外的部分科研單位也進(jìn)行了深層次的科研合作，不斷將科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。為更好的服務(wù)于廣大客戶，美析儀器國內(nèi)設(shè)有 12家辦事機(jī)構(gòu)，度身定制符合您需求的應(yīng)用解決方案，提高產(chǎn)品的附加值。在不斷服務(wù)國內(nèi)用戶的同時，美析也與 20 多個國家的分銷機(jī)構(gòu)建立了深度的戰(zhàn)略合作關(guān)系。

及國內(nèi)多項(xiàng)資質(zhì)審查認(rèn)證，并有著多項(xiàng)自行研發(fā)的光譜類專利版權(quán)等等）