超微量分光光度計(jì)檢測(cè)方法研究

摘要：超微量分光光度計(jì)目前成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域。應(yīng)用液體的表面張力特性，檢測(cè)時(shí)經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑，達(dá)到快速、微量、高濃度檢測(cè)吸光度的特點(diǎn)。本文闡述了如何用現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)超微量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，并舉例說(shuō)明對(duì)超微量分光光度計(jì)透射比、波長(zhǎng)和雜散光等主要指標(biāo)檢測(cè)方法。最后對(duì)超微量分光光度計(jì)日常檢測(cè)過(guò)程中可能遇到的問(wèn)題并對(duì)其進(jìn)行分析。

分光光度計(jì)是一類重要的分析儀器，無(wú)論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域 ，還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門(mén) ，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)都有廣泛而重要的應(yīng)用。分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。由于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量樣本量很小，于是超微量分光光度計(jì)應(yīng)運(yùn)而生。

目前超微量分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器，應(yīng)用液體的表面張力特性，樣品體積只需要0. 5～2μL，在檢測(cè)臺(tái)上，經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑達(dá)到快速、微量、高濃度及不用石英管、毛細(xì)管等耗材檢測(cè)吸光度的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域。

超微量分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成，與傳統(tǒng)分光光度計(jì)有明顯的不同。二者有以下 7 點(diǎn)區(qū)別:

(1)所需樣品體積小，僅需 0. 5 ～2μL;

(2)不需要比色皿，用移液槍直接將樣品滴加到檢測(cè)平臺(tái)上，測(cè)量時(shí)樣品自動(dòng)形成液柱，檢測(cè)完成后只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測(cè)平臺(tái)上擦拭干凈即可;

(3)一般具有1mm 和0.2mm 兩個(gè)光程(電機(jī)控制自動(dòng)選擇)，而傳統(tǒng)分光光度計(jì)的光程為10 mm，分光光度計(jì)樣品無(wú)需稀釋，測(cè)量范圍可達(dá)到常規(guī)分光光度計(jì)的50倍;

(4)氙氣閃光燈為燈源，代替了氘燈(紫外)和鎢燈(可見(jiàn))，使用壽命更長(zhǎng);

(5)不需要預(yù)熱，可隨時(shí)檢測(cè);

(6)顯示吸光度值的同時(shí)，程序直接給出濃度值(核酸、蛋白和熒光染料);

(7)體積比傳統(tǒng)分光光度計(jì)小很多(用體積數(shù)值表述)。

超微量分光光度計(jì)與傳統(tǒng)的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)工作原理相同，都是根據(jù)物質(zhì)的分子對(duì)紫外、可見(jiàn)區(qū)輻射(光)的選擇性吸收和朗伯 － 比爾(Lambert － Beer)定律對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析和定性鑒別的儀器。

朗伯 － 比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為:

A = -lg(I/I ₀ )= -lgT = klc

式中:A—物質(zhì)的吸光度;

I ₀ —入射的單色光強(qiáng)度;

I—透射的單色光強(qiáng)度;

T—物質(zhì)的透射比;

k—物質(zhì)的吸光系數(shù);

l—被分析物質(zhì)的光程;

c—物質(zhì)的濃度。

由此可見(jiàn)，單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光程)成正比。物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸光度，即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。

現(xiàn)行的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢定依據(jù)為 JJG178－2007《紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì)》國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程。其中規(guī)定透射比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.06000/1000重鉻酸鉀的0.001mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處測(cè)量透射比三次。重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液在相應(yīng)波長(zhǎng)下不同溫度的透射比值如表 1 所示。

超微量分光光度計(jì)檢測(cè)方法

透射比準(zhǔn)確度和重復(fù)性的測(cè)量

分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處，將重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液［紫外分光光度計(jì)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) GBW(E)130066］作為樣本進(jìn)行測(cè)量。

首先，超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)結(jié)果為吸光度值，然而紫外分光光度計(jì)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液)證書(shū)的特性量值用透射比表示。其次，超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)光徑為1mm 或0.2mm，和紫外分光光度計(jì)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)內(nèi)徑為10nm 的標(biāo)準(zhǔn)石英吸收池定值條件并不一致。這樣就需要對(duì)所測(cè)出的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

由朗伯－比爾定律 A = klc可知，被測(cè)物質(zhì)的光程和吸光度值成正比，可將超微量分光光度計(jì)波長(zhǎng)為313nm時(shí)，光徑為1mm 的吸光度值0. 030，擴(kuò)大10倍，轉(zhuǎn)化成光徑為10mm的吸光度值為0.300。同理，光徑為 0. 2mm的吸光度值0. 006，擴(kuò)大50倍，轉(zhuǎn)化成光徑10mm的吸光度值也為0.300。又根據(jù)朗伯－比爾定律 A =-lgT，可得 T =10-A 。超微量分光光度計(jì)波長(zhǎng)為 313nm 時(shí)，T =10-0. 300=50. 1%。

依據(jù) JJG178－2007《紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì)》國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程要求，分別在 235nm、257nm、313nm、350nm 處測(cè)量透射比三次。透射比最大允許誤差≤ ±2. 0%，透射比重復(fù)性≤1. 0%，符合Ⅳ級(jí)儀器指標(biāo)要求。

波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的測(cè)量

掃描氧化鈥的光譜曲線，依次查找 200nm～900nm 的指定波長(zhǎng)，配合圖譜下方的數(shù)據(jù)列表，找出氧化鈥光譜曲線的波峰值(與其對(duì)應(yīng)的則是光譜曲線透射比的波谷值)。

依據(jù) JJG178－2007 規(guī)程的計(jì)量性能要求，波長(zhǎng)在200nm～340nm 區(qū)段，最大允許誤差≤±2nm，波長(zhǎng)在340nm～900nm 區(qū)段，最大允許誤差≤± 4nm，波長(zhǎng)重復(fù)性≤1nm，符合Ⅳ級(jí)儀器指標(biāo)要求。

雜散光的測(cè)量

測(cè)量生化分析儀校準(zhǔn)用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(BW2025)中的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(注:溶液濃度為 50g/L) 根據(jù)朗伯 － 比爾定律，先將儀器測(cè)量的吸光度值轉(zhuǎn)化成光徑為 10mm 的吸光度值:A 10nm = 10A 1nm = 1. 412×10 =14. 12。超微量分光光度計(jì)波長(zhǎng)為 340nm 時(shí)雜散光的結(jié)果，轉(zhuǎn)化成 T =10^－A=10^{－14. 12}=0. 0%。依據(jù) JJG178 －2007 規(guī)程的計(jì)量性能要求，儀器雜散光(透射比)≤0. 1%，符合Ⅰ級(jí)儀器指標(biāo)要求。

常見(jiàn)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)中的問(wèn)題及分析

超微量分光光度計(jì)的零點(diǎn)漂移

用紫外分光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液)檢測(cè)儀器透射比準(zhǔn)確度，分別設(shè)置235nm、257nm、313nm、350nm 四點(diǎn)波長(zhǎng)，以空白溶液為參比，在對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下調(diào)零后，用紫外分光標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)量被測(cè)儀器的透射比。

測(cè)量結(jié)果與紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)透射比差別較大，且連續(xù)測(cè)量 3 次，對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響不大。

經(jīng)過(guò)測(cè)量結(jié)果數(shù)據(jù)分析，儀器經(jīng)轉(zhuǎn)化后的透射比結(jié)果比標(biāo)準(zhǔn)值小，得出吸光度值原始測(cè)量結(jié)果則比吸光度的標(biāo)準(zhǔn)值大，其中發(fā)現(xiàn)吸光度的誤差變化成線性，且誤差均是 0. 10。

這樣將標(biāo)準(zhǔn)空白溶液當(dāng)成樣本，測(cè)量空白溶液吸光度值，發(fā)現(xiàn)空白溶液的吸光度值為 0. 010(被測(cè)儀器的光徑為 1mm)。轉(zhuǎn)化成光徑為 10mm 的吸光度對(duì)應(yīng)正好也就相差 0. 10。這種方法可以測(cè)量出該儀器的零點(diǎn)漂移。把儀器的吸光度的本底減去后符合朗伯 － 比爾定律。

結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)上述的檢測(cè)方法闡述和問(wèn)題分析，對(duì)判斷超微量分光光度計(jì)的計(jì)量性能有了更加可行的手段和方法。依據(jù) JJG178 － 2007《紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì)》中的要求，并沒(méi)有規(guī)定對(duì)超微量分光光度計(jì)有效的檢測(cè)方法。因此結(jié)合計(jì)量部門(mén)的實(shí)際情況，設(shè)計(jì)一套有效的檢測(cè)方法，使得計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)得到有效的量值傳遞，也同時(shí)解決了超微量分光光度計(jì)此前無(wú)法量值溯源問(wèn)題，是值得在今后的工作中加以推廣并完善的。

儀器參數(shù)

UL-2000超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)

1．產(chǎn)品簡(jiǎn)介

超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)是一類很重要的分析儀器 ,無(wú)論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域 ,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門(mén) ,超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)都有廣泛而重要的應(yīng)用。超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)已成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

2．儀器特點(diǎn)   

*檢測(cè)所需樣微量，最低只需0.5ul ,超微量和比色皿雙平臺(tái)

*檢測(cè)范圍寬，比傳統(tǒng)的分光光度計(jì)的上限高100倍

*對(duì)于多數(shù)樣品而言，無(wú)需稀釋

*機(jī)器無(wú)需預(yù)熱，直接測(cè)量，無(wú)需檢測(cè)容器，日常消耗低

*全波長(zhǎng)190-1100nm，分辨率1nm，儀器都自動(dòng)給出全波長(zhǎng)的掃描結(jié)果190-850nm

*體積小巧，便攜式包裝，滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求

*通過(guò)PC控制實(shí)現(xiàn)更精確和靈活的測(cè)量

3．技術(shù)指標(biāo)   

*最小樣本量：0.5μl

*超微量光程：1mm/0.2mm/0.05mm（可選）

*比色杯光程：10mm/5mm/2mm/1mm

*波長(zhǎng)范圍：190～850nm

*波長(zhǎng)精度：1 nm

*波長(zhǎng)分辨率：≤0.3nm（FWHM 在 Hg 253.7nm）

*吸光率精度：2%（0.76 在 257nm）

*吸光率分辨精度：0.002Abs（1mm 光程）

*吸光率范圍：0.005～300 (等效10mm光程)

*可準(zhǔn)確測(cè)量范圍：0.01～0.5 Abs.±0.01Abs      0.5～80 Abs. ±2%

*偵測(cè)器：3648像素線性CCD陣列

*光源：微型氙氣閃光燈系統(tǒng)

*測(cè)量時(shí)間：<5 秒

*尺寸：200mm×130mm×136mm（L×W×H）

*重量：≤ 2.5kg

*樣本檢測(cè)平臺(tái)材質(zhì)：304 不銹鋼和石英

*輸入電壓：AC100～240V 50～60Hz*操作電源功率：24W

關(guān)于我們

上海美析儀器公司簡(jiǎn)介

上海美析儀器有限公司(以下簡(jiǎn)稱美析)，是一家具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高新技術(shù)企業(yè)，美析的創(chuàng)業(yè)理念“科技——因你改變”，并以此為企業(yè)宗旨，不斷探究、果敢創(chuàng)新。特別是在分析測(cè)試儀器領(lǐng)域，不斷開(kāi)發(fā)出先進(jìn)的產(chǎn)品，使美析成為優(yōu)質(zhì)儀器資源的供應(yīng)者。

美析主營(yíng)光譜類儀器可見(jiàn)分光光度計(jì)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、原子吸收光譜儀、超微量分光光度計(jì)、原子熒光光度計(jì)、ICP 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、ICP 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，目前，我們的產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)保、冶金、石油、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。同時(shí)美析利用在產(chǎn)品機(jī)械結(jié)構(gòu)、光學(xué)設(shè)計(jì)、電氣應(yīng)用和軟件開(kāi)發(fā)方面積累的豐富經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合市場(chǎng)的最新實(shí)際需求，近期將陸續(xù)推出一批全新的分析類儀器。美析的總部及生產(chǎn)基地設(shè)在上海，營(yíng)銷中心設(shè)在北京，并在江蘇、上海、山東三地建有研發(fā)基地。為充分利用各地的智力資源，美析與國(guó)內(nèi)外的部分科研單位也進(jìn)行了深層次的科研合作，不斷將科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。為更好的服務(wù)于廣大客戶，美析儀器國(guó)內(nèi)設(shè)有 12家辦事機(jī)構(gòu)，度身定制符合您需求的應(yīng)用解決方案，提高產(chǎn)品的附加值。在不斷服務(wù)國(guó)內(nèi)用戶的同時(shí)，美析也與 20 多個(gè)國(guó)家的分銷機(jī)構(gòu)建立了深度的戰(zhàn)略合作關(guān)系。

及國(guó)內(nèi)多項(xiàng)資質(zhì)審查認(rèn)證，并有著多項(xiàng)自行研發(fā)的光譜類專利版權(quán)等等）