基于超微量紫外掃描與生物效應(yīng)檢測鑒別佛手、香圓和枸櫞

目的：通過超微量紫外掃描與體外生物效應(yīng)對佛手、香圓、枸櫞進(jìn)行鑒別。方法：通過光學(xué)顯微鏡觀察3種藥材的粉末，采用超微量紫外掃描獲得佛手、香圓、枸櫞提取物的最大吸收波長，通過酶標(biāo)儀檢測藥材提取物的DPPH自由基清除、乙酰膽堿酯酶抑制和α - 葡萄糖苷酶抑制活性。結(jié)果：佛手、香圓、枸櫞粉末的顯微特征無明顯區(qū)別，其紫外最大吸收波長分別為323、285、270 nm，三者均無明顯的乙酰膽堿酯酶抑制活性，但均有顯著的α - 葡萄糖苷酶抑制活性，其中DPPH自由基清除活性可用于香圓與枸櫞的區(qū)分。結(jié)論：超微量紫外掃描結(jié)合體外生物效應(yīng)檢測是鑒別佛手、香圓、枸櫞的有效方法，且3種藥材含有潛在的DPPH自由基清除劑與α - 葡萄糖苷酶抑制劑。

中藥鑒定發(fā)展趨勢是簡便微量化和生物效應(yīng)鑒定。簡便性是中藥鑒定的基本要求，采用更少的試劑符合環(huán)境友好的原則，當(dāng)前基于紫外光譜的微型化鑒定方法發(fā)展迅速，該技術(shù)利用中藥提取物的紫外光譜特征進(jìn)行快速、無損的鑒定，極大提高了中藥鑒定的效率和準(zhǔn)確性，降低了中藥鑒定的成本。傳統(tǒng)的性狀、顯微、理化鑒定均與藥材的生物活性不直接相關(guān)。目前，《中華人民共和國藥典》和國家藥品監(jiān)督管理局均提出了中藥生物效應(yīng)鑒定指導(dǎo)原則。國內(nèi)學(xué)者也呼吁要增加中藥材的生物效應(yīng)指標(biāo)。然而，中藥的成分復(fù)雜、藥理作用機制不明確，給生物效應(yīng)鑒定帶來了一定的困難，絕大多數(shù)中藥缺乏個體化的生物效應(yīng)鑒定方法。盡管面臨著諸多挑戰(zhàn)，但發(fā)展中藥生物效應(yīng)鑒定仍是必然趨勢。佛手、香圓、枸櫞均來源于蕓香科、柑橘屬，三種植物的果實均可藥用。其中，香圓、枸櫞的干燥成熟果實為藥材香櫞的來源。佛手、香圓、枸櫞功效相似，均可疏肝理氣、化痰。傳統(tǒng)的性狀鑒定可用于佛手的辨識，但不易區(qū)分性狀特征相似的香圓和枸櫞。由于三種藥材親緣關(guān)系相近，其顯微特征存在相似性。此外，三種藥材均含有橙皮苷、柚皮苷等黃酮類成分，傳統(tǒng)的理化鑒定難以實現(xiàn)三者的區(qū)分。因此，有必要發(fā)展新型有效的鑒別方法用于區(qū)別佛手、香圓、枸櫞。本研究以同科同屬的佛手、香圓、枸櫞為研究對象，探索超微量紫外掃描與生物效應(yīng)檢測相結(jié)合的中藥鑒定方法。該鑒定方法符合簡便微量化且體現(xiàn)生物效應(yīng)發(fā)展趨勢，可為其他親緣關(guān)系相近的中藥鑒別提供參考，對于發(fā)展新型中藥鑒定策略具有積極意義。

儀器與試劑

BIOBASE - EL 10B型酶標(biāo)儀；

UL - 5000型超微量紫外分光光度計（上海美析儀器有限公司，型號：UL - 5000）；

F - 010S型超聲波清洗器（深圳市鈺潔清洗設(shè)備有限公司，型號：F - 010S）；

力辰 101 型烘箱、力辰 LC -Vortex - P2 型點動混勻儀、FA1004 型電子分析天平（上海力辰儀器科技有限公司，型號：FA1004）。

佛手、香圓、枸櫞果實（批號：2021113001，浙江金華、江蘇鎮(zhèn)江、云南大理）；

1，1 - 二苯基 - 2 - 苦基肼、碘化乙酰硫代膽堿、5，5'- 二硫代雙（2-硝基苯甲酸）［批號：C10636623、H1803032、E1922062，阿拉丁試劑（上海）有限公司］；

4 - 硝基苯基 - α - D - 吡喃葡萄糖苷、乙酰膽堿酯酶（批號：J29GS156009、Y23O11Q128361，上海源葉生物科技有限公司）；

α - 葡萄糖苷酶（批號：20200525001，上海鼓臣生物技術(shù)有限公司）。

實驗方法

樣品溶液的制備：分別稱取佛手、香圓、枸櫞粉末0. 1 g，精密稱定，置于離心管中，加甲醇10 mL，超聲提取30 min，搖勻，采用針式過濾器過濾，即得。

粉末顯微鑒定：取佛手、香圓、枸櫞粉末少量，置于載玻片上，滴加飽和水合氯醛2滴，酒精燈加熱至透化，滴加稀甘油2滴，加蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

超微量紫外掃描：啟動超微量紫外分光光度計，用移液槍吸5 μL水清洗3次，再吸1 μL甲醇作為空白對照。分別吸取1 μL佛手、香圓、枸櫞提取物進(jìn)行檢測，確定最大吸收波長。

體外生物活性檢測：DPPH自由基清除活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性、α - 葡萄糖苷酶抑制活性的步驟以及陽性對照參考本研究組研究成果。

DPPH自由基清除活性：分別取佛手、香櫞、枸櫞溶液300 μL于不同離心管中作為第1個濃度點，再取300 μL溶液于300 μL甲醇中作為第2個濃度點，依次對半稀釋作為梯度濃度。樣品孔先滴加50 μL樣品，再滴加150 μL DPPH溶液，每個濃度設(shè) 4 個復(fù)孔?？瞻卓准尤?span> 50 μL 甲醇、150 μL DPPH 溶液，進(jìn)板分析。所得數(shù)據(jù)用軟件GraphPadPrism分析處理 。

乙酰膽堿酯酶活性：配制梯度濃度的佛手、香櫞、枸櫞溶液作為樣品。每孔加110 μL PBS溶液（pH值8），再滴加20 μL樣品，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔。對照組加入110 μL PBS（pH值8）、20 μL空白溶液。用排槍滴加20 μL的酶液（0. 3 U/mL），孵育5 min后使用排槍50 μL碘化乙酰硫代膽堿與5，5' - 二硫代雙（2 - 硝基苯甲酸）的混合溶液，進(jìn)板分析，在405 nm下讀取吸光度，每個樣品板共計20 min。所得數(shù)據(jù)用軟件GraphPadPrism分析處理。

α - 葡萄糖苷酶抑制活性：向樣品孔滴加30 μL樣品，然后滴加30 μL α - 葡萄糖苷酶溶液（0. 8 U/mL），每個濃度設(shè)4個復(fù)孔?？瞻讓φ占尤?span>30 μL溶劑、30 μL酶溶液。孵育30 min后用排槍加入90 μL PNPG溶液，進(jìn)板分析。所得數(shù)據(jù)用軟件GraphPadPrism分析處理。

結(jié)果

外觀鑒定：佛手外觀形似手指，成熟果實表面黃色；香圓與枸櫞的形狀均為類圓形或橢圓形，成熟果實表面黃色，未成熟部分為綠色。

顯微鑒定：三種藥材的粉末顯微特征。佛手、香圓、枸櫞的導(dǎo)管均成束且多為螺紋導(dǎo)管，中果皮薄壁組織為不規(guī)則的多邊形，邊緣不均勻增厚。整體而言，佛手、香圓、枸櫞的粉末顯微特征相似，不易區(qū)分。

紫外最大吸收波長鑒定：佛手、香圓、枸櫞提取物的超微量紫外波長掃描圖。三種藥材的最大吸收波長分別為 323、285、270 nm，最大吸收波長具有顯著差異。因此，可通過最大吸收波長區(qū)分佛手、香圓、枸櫞。而且，超微量紫外掃描法操作簡單，所需要的樣品量為微升級別，符合中藥鑒定簡便微型化的要求。

體外生物活性鑒定：佛手、香圓、枸櫞提取物的 DPPH 自由基清除活性、乙酰膽堿酯酶的抑制活性、α - 葡萄糖苷酶抑制活性。佛手、香圓的自由基清除率超過了50%，其IC 50 值分別為1. 56、1. 93 mg/mL，枸櫞的DPPH自由基清除活性低于佛手、香圓?？紤]到香圓和枸櫞具有相似的性狀特征，DPPH自由基清除活性可用于二者的區(qū)分。3種藥材均無明顯的乙酰膽堿酯酶抑制活性。佛手、香圓、枸櫞均有較強的 α - 葡萄糖苷酶抑制活性，其IC 50 值分別為0. 10、0. 12、0. 09 mg/mL，表明3種藥材中含有潛在的α - 葡萄糖苷酶抑制劑。

討論

佛手、香圓、枸櫞具有很多共性特征：三者親緣關(guān)系接近，均來源于蕓香科柑橘屬；三者功效相近，均可疏肝理氣、化痰；三者的主要成分均為黃酮類。除了藥用，佛手、香圓、枸櫞還常用作保健茶，具有較大的市場需求量。在商品規(guī)格中，3種藥材常切絲用，由于三者在多個方面存在共性特征，這為藥材鑒別帶來了一定的挑戰(zhàn)。針對該問題，本研究采用傳統(tǒng)的顯微鑒定方法發(fā)現(xiàn)，3種藥材均具有相似的導(dǎo)管、中果皮薄壁組織，結(jié)果顯示三者難以區(qū)分?；诖朔N情況，本文提出一種超微量紫外掃描結(jié)合體外生物效應(yīng)檢測的整合策略，以實現(xiàn)親緣關(guān)系相近中藥的準(zhǔn)確鑒別。結(jié)果顯示，3種藥材的提取物在最大吸收波長處具有明顯區(qū)別。在體外生物活性檢測方面，3種藥材在自由基清除方面具有差異，可用于區(qū)分外觀相似的枸櫞與香圓。此外，3種藥材均具有較強的α - 葡萄糖苷酶抑制活性，表明藥材中可能含有抑制α - 葡萄糖苷酶的先導(dǎo)化合物。佛手、香圓、枸櫞用作保健茶可能與其潛在的降糖作用有關(guān)。

結(jié)論

超微量紫外掃描結(jié)合體外生物效應(yīng)檢測是鑒別佛手、香圓、枸櫞的有效方法。該方法符合當(dāng)前中藥鑒定簡便微量化、體現(xiàn)生物效應(yīng)的發(fā)展趨勢。3種藥材含有潛在的自由基清除劑與α - 葡萄糖苷酶抑制劑，可為后續(xù)先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)奠定前期基礎(chǔ)。

儀器參數(shù)

UL-5000超微量紫外可見分光光度計產(chǎn)品參數(shù)

1．產(chǎn)品簡介

超微量紫外可見分光光度計是一類很重要的分析儀器 ,無論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域 ,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門 ,超微量紫外可見分光光度計都有廣泛而重要的應(yīng)用。超微量紫外可見分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。超微量紫外可見分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。

2．儀器特點

*檢測所需樣微量，最低只需0.3ul ,超微量和比色皿雙平臺

*檢測范圍寬，比傳統(tǒng)的分光光度計的上限高500倍

*對于多數(shù)樣品而言，無需稀釋

*機器無需預(yù)熱，直接測量，無需檢測容器，日常消耗低

*全波長190-1100nm，分辨率1 nm，儀器都自動給出全波長的掃描結(jié)果190-900nm

*體積小巧，便攜式包裝，滿足現(xiàn)場檢測的需求

*通過PC控制實現(xiàn)更精確和靈活的測量

3．技術(shù)指標(biāo)

*最小樣本量：0.3μl

*超微量光程：0.02～1mm連續(xù)光程，自動切換

*比色杯光程：10mm/5mm/2mm/1mm

*波長范圍：190～900nm

*波長精度：1 nm

*波長分辨率：1 nm

*吸光率精度：±1%（0.76 在 260nm）

*吸光率分辨精度：0.002Abs（1mm 光程）

*吸光率范圍：0-750A（等效10mm光程）

*OD600吸光度范圍：0～4.000Abs

*OD600吸光度穩(wěn)定性：[0，3）≤0.5%，[3，4）≤2%

*OD600吸光度重復(fù)性：[0，3）≤0.5%，[3，4）≤2%

*核酸檢測范圍：1.5~37500 ng/μl（dsDNA），檢測下限1.5 ng/μl

*蛋白檢測范圍：0.05~1110 mg/ml（BSA），0.03~540 mg/ml（IgG）

*檢測器：紫外增強型cmos線陣傳感器

*光源：進(jìn)口微型氙氣閃光燈系統(tǒng)，閃爍10⁹次，壽命長達(dá)10年

*測量時間：<3秒

*液晶屏：7寸觸摸操作屏，安卓系統(tǒng)

*采用固定光程原理，終身無需校正?？蓹z測易揮發(fā)溶劑的樣品

*樣本檢測平臺材質(zhì)：304 不銹鋼和石英

關(guān)于我們

上海美析儀器公司簡介

上海美析儀器有限公司(以下簡稱美析)，是一家具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高新技術(shù)企業(yè)，美析的創(chuàng)業(yè)理念“科技——因你改變”，并以此為企業(yè)宗旨，不斷探究、果敢創(chuàng)新。特別是在分析測試儀器領(lǐng)域，不斷開發(fā)出先進(jìn)的產(chǎn)品，使美析成為優(yōu)質(zhì)儀器資源的供應(yīng)者。

美析主營光譜類儀器可見分光光度計、紫外可見分光光度計、原子吸收光譜儀、超微量分光光度計、原子熒光光度計、ICP 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、ICP 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，目前，我們的產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于有機化學(xué)、無機化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)保、冶金、石油、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。同時美析利用在產(chǎn)品機械結(jié)構(gòu)、光學(xué)設(shè)計、電氣應(yīng)用和軟件開發(fā)方面積累的豐富經(jīng)驗，結(jié)合市場的最新實際需求，近期將陸續(xù)推出一批全新的分析類儀器。美析的總部及生產(chǎn)基地設(shè)在上海，營銷中心設(shè)在北京，并在江蘇、上海、山東三地建有研發(fā)基地。為充分利用各地的智力資源，美析與國內(nèi)外的部分科研單位也進(jìn)行了深層次的科研合作，不斷將科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。為更好的服務(wù)于廣大客戶，美析儀器國內(nèi)設(shè)有 12家辦事機構(gòu)，度身定制符合您需求的應(yīng)用解決方案，提高產(chǎn)品的附加值。在不斷服務(wù)國內(nèi)用戶的同時，美析也與 20 多個國家的分銷機構(gòu)建立了深度的戰(zhàn)略合作關(guān)系。

及國內(nèi)多項資質(zhì)審查認(rèn)證，并有著多項自行研發(fā)的光譜類專利版權(quán)等等）