紫外分光光度法測(cè)定木豆葉中芪類(lèi)化合物的含量

目的：建立木豆葉中芪類(lèi)化合物的含量測(cè)定方法。

方法：采用紫外分光光度法在320ｎｍ處，以白藜蘆醇為對(duì)照品測(cè)定吸收度，并計(jì)算其含量。

結(jié)果：芪類(lèi)化合物測(cè)定濃度的線性范圍為1.300～7.150μｇ／ｍｌ（ｒ２＝0.9960）；平均回收率為101.54％，ＲＳＤ＝0.73％（ｎ＝６）。結(jié)論：該法簡(jiǎn)便，重復(fù)性、 穩(wěn)定性良好，可作為木豆葉中芪類(lèi)化合物含量測(cè)定方法。

木豆葉為豆科植物木豆Ｃａｊａｎｕｓ?。悖幔辏幔睿ǎ蹋?Ｍｉｌｌｓｐ．的干燥葉，夏、秋二季采收，除去枝梗及雜質(zhì)， 曬干。木豆別名觀音豆、樹(shù)豆、三葉豆、野黃豆、山豆根。為世界第六大食用豆類(lèi)，也是唯一的木本食用 豆類(lèi)。主要分布于東南亞、印度、緬甸及我國(guó)云南、四川、江蘇、廣東、廣西和海南等地。木豆葉脂溶性成分主要含芪類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物，其中，木豆葉提取物中芪類(lèi)化合物是一類(lèi)具有廣泛藥用價(jià)值的藥物，具有廣泛的藥理作用，如抗骨質(zhì)疏松、降血糖、降血脂、膽固 醇等，其藥效和一線用藥相當(dāng)，而且毒副作用小。

現(xiàn)有木豆葉未列入《中國(guó)藥典》，僅列入《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2004年，但標(biāo)準(zhǔn)很低，未有含量測(cè)定項(xiàng)?，F(xiàn)有木豆葉含量研究有佟美鴻［５］的高效液相色 譜法測(cè)定木豆黃酮類(lèi)物質(zhì)中牡荊苷、異牡荊苷和葒草苷。鄭菲艷等的木豆葉總黃酮含量測(cè)定方法。張俊清等的木豆葉中牡荊苷、異美五針?biāo)呻p氫黃酮和木豆芪同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜法?？子鸬氖状谓⒏咝б合喾椒y(cè)定木豆葉中木豆素。王惠娟等的木豆葉中木豆多糖測(cè)定方法。張俊清等對(duì)木豆葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了深入研究。上述文獻(xiàn)均未見(jiàn)單獨(dú)測(cè)定木豆葉中芪類(lèi)總量的研究報(bào)告。因?yàn)槟径谷~作為抗骨質(zhì)疏松的中藥材，有明確報(bào)道木豆素這類(lèi)芪類(lèi)物質(zhì)發(fā)揮主要作用，而本課題是通過(guò)建立芪類(lèi)化合物總量測(cè)定方法，對(duì)木豆葉提取純化工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)報(bào)道芪類(lèi)化合物的分子中都含有1，2－二苯乙烯的基本骨架，318ｎｍ 的吸收是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)雙鍵連接起來(lái)的長(zhǎng)共軛體系的產(chǎn)生，是其特征波長(zhǎng)。所以，采用白藜蘆醇作為對(duì)照品進(jìn)行，通過(guò)測(cè)定木豆葉提取物中紫外吸收，建立測(cè)定芪類(lèi)化合物總量方法。

1儀器與藥材

紫外分光光度儀（UV1500，上海美析儀器有限公司）；萬(wàn)分之 一天平（瑞士梅特勒天平公司，型號(hào) ＸＰＲ１０）；超聲波恒溫清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，ＳＢＬ－２２ＤＴ，６００Ｗ，４０ＫＨｚ）白藜蘆醇對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：ｗｋｑ１９０２２２０１，純 度≥９８％）；木豆葉藥材（安國(guó)市義通中藥材有限公 司），木豆葉藥材提取物（內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司自制）；乙醇（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)開(kāi)發(fā)公司）為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱定白藜蘆醇對(duì)照品適量，用乙醇溶解，配成12.8μｇ／ｍｌ，搖勻，即得。

2.2供試品溶液的制備

取木豆葉提取物0.10ｇ，精密稱定，置25ｍｌ量瓶 中，加適量乙醇溶解，超聲（20℃、90％）20ｍｉｎ，用乙醇定容至刻度，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取2.1和2.2項(xiàng)下對(duì)照品和供試品溶液，在200～800ｎｍ波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖１。

從圖１可見(jiàn)，在紫外區(qū)內(nèi)，白藜蘆醇的最大吸收波長(zhǎng)為320ｎｍ，木豆葉提取物芪類(lèi)化合物最大吸收波長(zhǎng)為318ｎｍ。從圖譜上看，木豆葉提取物芪類(lèi)化合物的波峰沒(méi)有白藜蘆醇的波峰尖，經(jīng)過(guò)對(duì)木豆葉提取物芪類(lèi)化合物波峰附近的吸收度進(jìn)行對(duì)比，在318～320ｎｍ 區(qū)間的吸光度差別不大，差別在0.005～0.002之間。綜合考慮本試驗(yàn)選定320ｎｍ作為測(cè)定波長(zhǎng)。  

因此，以白藜蘆醇為標(biāo)準(zhǔn)在320ｎｍ 測(cè)定木豆葉提取物芪類(lèi)化合物含量。

2.4線性關(guān)系考察

精密吸取2.1項(xiàng)下白藜蘆醇對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、5.5ｍｌ，置10ｍｌ量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在320ｎｍ下測(cè)定吸光 度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，白藜蘆醇濃度（μｇ／ｍｌ）為 橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。得 ｙ＝0.0946ｘ＋0.0349，ｒ２＝0.9960，見(jiàn)圖２，說(shuō)明白藜 蘆醇對(duì)照品濃度在1.300～7.150μｇ／ｍｌ范圍內(nèi)與吸 光度線性關(guān)系良好。

2.5精密度考察

精密吸取2.1項(xiàng)下白藜蘆醇對(duì)照品溶液4ｍｌ，置10ｍｌ容量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在320ｎｍ 下測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度值，計(jì)算RSD。結(jié)果表明對(duì)照品溶液 吸光度的RSD為0.06％ （ｎ＝6），說(shuō)明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性考察

取同一批次的木豆葉提取物Ⅱ6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1ｍｌ，置100ｍｌ量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在320ｎｍ下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中 芪類(lèi)化合物的含量及RSD值。結(jié)果表明芪類(lèi)化合物 含量為96.13ｍｇ／ｇ，RSD值為2.3％，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性考察

取木豆葉提取物Ⅱ，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液2ｍｌ，置100ｍｌ量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，分別于0、30、60、90、120、150、180ｍｉｎ在320ｎｍ 波長(zhǎng)處 測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD。結(jié)果表明供試品吸光度的RSD為1.33％，表明供試品在180ｍｉｎ內(nèi)較穩(wěn)定。

2.8加樣回收率考察

2.8.1對(duì)照品的配制

精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品適量，用乙醇溶解配置成13.04μｇ／ｍｌ。

2.8.2供試品的制備

精密稱取木豆葉提取物Ⅱ０．１０ｇ，置２５ｍｌ容量瓶 中，加適量乙醇溶解，超聲（２０℃、９０％）２０ｍｉｎ，乙醇定 容至刻度，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.8.3加樣回收率測(cè)定

精密量取2.6項(xiàng)下各供試品溶液0.5ｍｌ，置于100ｍｌ量瓶中，乙醇定容至刻度，搖勻，在320ｎｍ 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。 分別取對(duì)照品溶液15ｍｌ和各供試品溶液0.5ｍｌ，置于100ｍｌ量瓶中，乙醇定容至刻度，搖勻，在320ｎｍ波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。計(jì)算加樣回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表１。

2.9含量測(cè)定

2.9.1提取物中芪類(lèi)化合物含量測(cè)定

共收集到５批次木豆葉提取物樣品。按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液2ｍｌ （木豆葉提取物 Ⅱ 為精密量取1ｍｌ），置100ｍｌ量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在320ｎｍ下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中芪類(lèi)化合物的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表２。

2.9.2木豆葉藥材中芪類(lèi)化合物含量測(cè)定

取木豆葉藥材１．０ｇ，平行２份，精密稱定。分別置具塞錐形瓶中，加２５ｍｌ乙醇溶解，稱定重量，超聲 （２０℃、９０％）２０ｍｉｎ，用乙醇補(bǔ)足失重，濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液１ｍｌ，置１００ｍｌ 容量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻。以相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在３２０ｎｍ 下測(cè)定吸光度，計(jì)算木豆葉藥材樣品中芪類(lèi)化合物的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表３。

3討論

芪類(lèi)化合物的分子中都含有１．２－二苯乙烯的 基本骨架，其中２個(gè)芳香環(huán)上有不同的取代基，常見(jiàn) 的取代基是羥基，據(jù)報(bào)道羥基周?chē)江h(huán)上的 Ｈ 被異 戊烯基取代將大大增加該類(lèi)化合物的生理和藥理活 性［３］，因此，異戊烯基芪類(lèi)化合物是近年來(lái)研究的熱 點(diǎn)。木豆葉具有代表性的芪類(lèi)化合物木豆素、木豆素 Ａ、木豆素 Ｃ，均為具有異戊烯基的芪類(lèi)化合物，其中， 木豆葉芪類(lèi)提取物具有廣泛的藥理作用，如抗骨質(zhì)疏 松藥理作用等，為本課題的研究重點(diǎn)。 木豆葉提取物為用８０％乙醇提取后，再上 ＡＢ－ ８大孔樹(shù)脂，用水及不同濃度乙醇洗脫的提取物，如表１，用新建立的方法，可以定量檢測(cè)出提取純化效果.

儀器參數(shù)

UV-1500PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)

儀器特點(diǎn)

*采用單片微機(jī)控制，128*64位液晶顯示

*寬大的液晶顯示器可顯示多組數(shù)據(jù)

*巨大的內(nèi)存空間，可存儲(chǔ)多組數(shù)據(jù)和曲線

*自動(dòng)調(diào)0、調(diào)100%功能

*波長(zhǎng)自動(dòng)調(diào)節(jié)

*光源自動(dòng)切換，濾色片自動(dòng)切換

*寬大樣品池（5mm～100mm）

*具有最多十點(diǎn)標(biāo)樣建標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量功能

*可通過(guò)直接輸入K、B因子建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測(cè)量

*可直接輸入標(biāo)樣和對(duì)應(yīng)濃度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測(cè)量

*可斷電保存測(cè)量設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

*配備通用并行打印接口，可打印標(biāo)題欄、測(cè)量數(shù)據(jù)、曲線參數(shù)、曲線標(biāo)準(zhǔn)樣品點(diǎn)和曲線

*配USB接口

*可通過(guò)PC軟件控制實(shí)現(xiàn)光譜掃描等更精確和靈活的測(cè)量要求

技術(shù)指標(biāo)及基本參數(shù)

*波長(zhǎng)范圍： 190～1100nm

*光譜帶寬： 2nm

*波長(zhǎng)準(zhǔn)確度：±0.5nm

*波長(zhǎng)重現(xiàn)性：≤0.2nm

*透射比準(zhǔn)確度: ±0.3% τ

*透射比重復(fù)性：0.15% τ

*雜散光：≤0.05% τ (220nm NaI，340nm NaNO2)

*穩(wěn)定性： 0.001A/h（500nm預(yù)熱后）

*測(cè)光方式：透過(guò)率、吸光度、濃度、能量

*波長(zhǎng)調(diào)節(jié)：自動(dòng)調(diào)節(jié)

*光度范圍： -0.3～3A

*顯示方式： 128*64液晶

*檢測(cè)器：進(jìn)口硅光二極管

*光源：進(jìn)口氘燈，進(jìn)口鎢燈

*電源： AC 220V/50Hz或110V/60Hz

*功率： 120W

*儀器尺寸：480×350×220mm

*主機(jī)凈重： 15Kg