分光光度法測定羊毛織物上膠原蛋白的含量

膠原蛋白是一種廣泛分布于皮膚、肌腱及骨骼等組織中的結(jié)構(gòu)蛋白，約占總蛋白質(zhì)含量的1/3，由三條肽鏈擰成螺旋形纖維狀，能有效鎖住水分，并具有保濕因子，可以發(fā)揮良好的保濕護(hù)膚作用。此外，膠原蛋白還表現(xiàn)出極佳的生物相容性和降解性能。膠原蛋白功能性整理技術(shù)的研發(fā)已成為國內(nèi)外科研領(lǐng)域的熱點。韓國富元公司研發(fā)了一種整理工藝，先采用酶對棉織物進(jìn)行前處理再浸軋膠原蛋白溶液，從而將膠原蛋白牢牢地吸附在織物表面，以賦予棉織物吸濕保濕性，織物的手感更貼近自然。許云輝等采用高碘酸鈉先將棉纖維分子鏈上的羥基局部選擇性氧化成醛基，再浸軋膠原蛋白溶液，使膠原蛋白肽鏈上的氨基與醛基進(jìn)行化學(xué)鍵合，將膠原蛋白牢固粘結(jié)在棉纖維上，制備了親和、舒適的膠原蛋白涂層棉纖維材料。張燕等深入研究了膠原蛋白改性對亞麻纖維性能的影響，結(jié)果顯示改性后的亞麻纖維在熱穩(wěn)定性與防紫外線性能上顯著提升，折皺回復(fù)性有所下降。孔祥曌等采用羊絨與交聯(lián)劑（戊二醛和異佛爾酮二異氰酸）的架橋作用實現(xiàn)膠原蛋白在其表面的接枝改性，改性后羊絨強度和上染百分率均得到提高，白度基本不受影響。

目前對整理到紡織品上膠原蛋白含量的檢測研究很少，僅有韓瑩瑩、譚玉靜等人以9-芴甲基氯甲酸酯為衍生劑，采用柱前衍生-液相色譜法測定的報道，但其操作費時并且價格昂貴，許多實驗室并不具備此類精密的儀器。因此，探索如何快速簡便地測試整理到羊毛織物上膠原蛋白含量的方法具有一定的意義。羊毛織物與膠原蛋白都屬于蛋白質(zhì)，但它們的氨基酸組成存在差異。膠原蛋白中富含羥脯氨酸這一特殊氨基酸，因此，可以通過定量測定羥脯氨酸來表征膠原蛋白的含量。測定羥脯氨酸含量的方法有比色法、毛細(xì)管電泳法、氨基酸自動分析法、氣相色譜法[16]和高效液相色譜法等。比色法又稱對二甲氨基苯甲醛法或氯胺T顯色法，是利用特定化學(xué)物質(zhì)與羥脯氨酸反應(yīng)生成有色化合物，并通過比色測定該反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度來確定羥脯氨酸含量。

在當(dāng)前眾多羥脯氨酸含量檢測方法中，雖然色譜法和氨基酸分析儀法具有準(zhǔn)確性、靈敏度和精密度高等優(yōu)勢，但其操作耗時且費用較高。比色法因簡便操作和對試驗條件要求不高而被廣泛采用?；谝陨显?，本文以整理到羊毛織物上的膠原蛋白為檢測樣本，采用比色法測定羥脯氨酸的含量，乘以相應(yīng)系數(shù)轉(zhuǎn)化為膠原蛋白的含量，從而計算出羊毛織物上膠原蛋白的含量。

1.    實驗部分

1.1織物、試劑及儀器

織物羊毛織物（無錫協(xié)新毛紡織有限公司），羊絨織物（內(nèi)蒙古鹿王羊絨有限公司）

試劑明膠、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅱ（包頭東寶生物技術(shù)股份有限公司），L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（L-HYP，純度≥98%），濃硫酸、無水乙酸鈉、氫氧化鈉、正丙醇、一水檸檬酸、異丙醇、對二甲氨基苯甲醛、高氯酸、氯胺T（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）

儀器UV-1500PC紫外可見分光光度計（上海美析儀器有限公司），AB104-N型電子天平（瑞士METTLERTO?LEDO公司），立式小軋車（佛山市亞力諾精密機械制造有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）

1.2實際的配制

1.2.1緩沖溶液（pH=6.4）

取6.5g一水檸檬酸、3.5g氫氧化鈉、19.5g無水乙酸鈉于250mL燒杯中，用水溶解并轉(zhuǎn)入250mL容量瓶中，加入62.5mL正丙醇，用水定容。

1.2.2氯胺T溶液（C=0.062mol/L）

稱取1.41g三水·N-氯-對甲苯磺酰胺鈉鹽（氯胺T），用100mL上述配制的緩沖溶液溶解。

1.2.3顯色劑溶液

稱取2g對二甲氨基苯甲醛，用7mL60%高氯酸溶液溶解，再緩慢加入13mL異丙醇，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3試驗方法

1.3.1反應(yīng)機理

膠原蛋白經(jīng)過3mol/L的硫酸溶液105℃消解后，可分解出羥脯氨酸，羥脯氨酸被氯胺T溶液氧化為吡咯，吡咯與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色化合物，在559nm處具有最大吸收，反應(yīng)機理見圖1。

1.3.2L-羥脯氨酸濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

L-羥脯氨酸工作液的配制：精確稱取50.00mgL-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，用去離子水溶解，加一滴3mol/L的硫酸溶液用水定容，配制成0.5000g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。從中準(zhǔn)確移取5mL置于500mL容量瓶中，用去離子水將溶液定容。分別量取稀釋后的溶液10、20、30、40mL于100mL容量瓶中，用水定容，配制成質(zhì)量濃度依次為0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

顯色與測試：分別移取4mL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液于比色管中，加入2mL氯胺T試劑，室溫下放置20min，再加入2mL顯色劑。為避免反應(yīng)過程中受光線干擾，將比色管用錫箔紙包裹，放入60℃水浴中反應(yīng)20min，取出比色管，用流動水冷卻至少3min，室溫下靜置30min。將氧化顯色反應(yīng)后的標(biāo)準(zhǔn)工作液在500~650nm波長范圍內(nèi)掃描，測定吸收光譜曲線，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)工作液在559nm處有最大吸收，因此在559nm處檢測不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液的吸光度。

同時做空白樣，用去離子水代替標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)上述步驟測定其吸光度。以扣除空白樣的吸光度為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。

1.3.3樣品的檢測

樣品的制備：取一定質(zhì)量的羊毛織物（0.1~4.0g），在常溫下將其浸入不同質(zhì)量濃度的膠原蛋白溶液中（0.1~100g/L），一浸一軋，帶液率100%左右。處理后的羊毛織物置于燒瓶中備用。

樣品的消解與稀釋：量取30mL硫酸溶液（3mol/L）置于上述燒瓶中，在105℃干燥箱中恒溫消解16h，接著用圓形濾紙趁熱將消解產(chǎn)物過濾至250mL容量瓶中，用10mL濃度為3mol/L的硫酸溶液分三次洗滌燒瓶和濾紙，合并溶液，用水定容搖勻。用移液管移取25mL上述消解液至250mL容量瓶中用水定容搖勻。

顯色與測試：與1.3.2節(jié)步驟相同。

同時做空白樣，以同質(zhì)量、同顏色的羊毛織物消解液重復(fù)上述步驟，測定其吸光度。

1.3.4結(jié)果計算

根據(jù)樣品測定的吸光度，扣除其相應(yīng)的空白值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到樣品中羥脯氨酸的質(zhì)量濃度，再代入式（1），計算樣品中膠原蛋白的含量。

方法來源：[1]趙咪咪,楊瑞婷,王富榮,等.分光光度法測定羊毛織物上膠原蛋白的含量[J].印染,2024,50(07):69-73.

UV-1500PC紫外可見分光光度計

儀器特點

*采用單片微機控制，128*64位液晶顯示

*寬大的液晶顯示器可顯示多組數(shù)據(jù)

*巨大的內(nèi)存空間，可存儲多組數(shù)據(jù)和曲線

*自動調(diào)0、調(diào)100%功能

*波長自動調(diào)節(jié)

*光源自動切換，濾色片自動切換

*寬大樣品池（5mm～100mm）

*具有最多十點標(biāo)樣建標(biāo)準(zhǔn)曲線測量功能

*可通過直接輸入K、B因子建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測量

*可直接輸入標(biāo)樣和對應(yīng)濃度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測量

*可斷電保存測量設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

*配備通用并行打印接口，可打印標(biāo)題欄、測量數(shù)據(jù)、曲線參數(shù)、曲線標(biāo)準(zhǔn)樣品點和曲線

*配USB接口

*可通過PC軟件控制實現(xiàn)光譜掃描等更精確和靈活的測量要求